Спектрофотометрия в уф и видимой областях (офс.1.2.1.1.0003.15) : farmf

Как устроен прибор?

Абсолютно все автоматизированные фотоэлектроколориметры состоят из: источника света (вольфрамовой, дейтериевой или галогено-дейтериевой лампы); усилителя сигналов; фотоприемника; монохроматора; оптических составляющих (световодов, зеркала, призмы и стекла); отсека для реагента.

Монохроматор содержит дифракционную решетку либо призму, которые выделяют излучение определенной длины волны. В различных моделях есть от одного до четырех отсеков для проб. С помощью фотоприемников спектрофотометр фиксирует уровень светового излучения, который проходит сквозь биологический материал.

Наиболее современные приборы укомплектованы фотодиодной матрицей, в состав которой входит встроенный датчик. Чип преобразует световой сигнал в электрический, это фиксируется микроконтроллером и высвечивается на мониторе оборудования. Не достаточно мощные приборы обрабатывают волны с различной длиной постепенно, и только потом выводят результаты на дисплей. От количества фотодиодных датчиков зависит производительность и информативность спектрофотометра.

С помощью приборов с фотодиодной матрицей можно проводить оперативные исследования не отходя от производства либо во время возникновения химической реакции. Это позволяет детально проанализировать состояние реакционных веществ.

Особенности работы устройства

Спектрофотометрическая методика основана на измерении степени отражения или поглощения монохроматических световых лучей. Во время исследования посторонние факторы не могут влиять на результативность анализа. Все приборы работают на двух разновидностях схем. В первом случае на пробу попадает монохроматический световой луч с определенной длиной волны, который после прохождения через образец направляется на фотоприемник, измеряющий разницу между потоками.

Суть второй схемы заключается в том, что на реагент попадает световой поток прямо от лампы, затем монохроматор выделяет небольшой пучок и направляет его к фотоприемнику.

Спектрофотометры бывают однолучевыми и двухлучевыми. В приборах с одним лучом для измерения применяются коэффициенты коррекции. В случае двухлучевой диагностики один луч попадает на пробу, а второй – на эталонное значение. Оборудование с двумя лучами более точное, информативное и менее чувствительное к окружающим факторам.

Лучшие материалы месяца

Коронавирусы: SARS-CoV-2 (COVID-19)
Антибиотики для профилактики и лечения COVID-19: на сколько эффективны
Самые распространенные «офисные» болезни
Убивает ли водка коронавирус
Как остаться живым на наших дорогах?

Сферы применения

Спектрофотометры используются для исследований в биохимии (анализируются липиды, электролиты, субстраты, ферменты), иммунохимии (проводится анализ ламбда, ферритин, миоглобин, микроальбумин, гаптоглобин), бактериологии. Для анализа качества еды и воды (сточной, природной и питьевой) применяется фотоэлектроколориметр. При определении качественных характеристик воды определяется мутность и цвет жидкости, наличие тяжелых металлов и поверхностно-активных компонентов, содержание нитритов, фосфатов, фенолов и сульфатов.

Спектрофотометр пригодится для проведения научных, гормональных, экологических и специальных исследований. В отделениях санитарно-эпидемиологического надзора обязательным является наличие данного прибора. Кроме медицины оборудование используется в сельском хозяйстве и промышленной отрасли.

Фотоэлектрический фотометр нужен для:

выявления чистоты исследуемых образцов и нахождения примесей;
измерения в жидкостях оптической плотности и ее изменений;
определения концентрации пробы (исследование проводится в медицинских учреждениях);
изучения, анализа состава и химического строения веществ, образцов и реактивов;
спектральной диагностики.

Фотоэлектроколориметр – это устройство, которое применяется для проведения различных исследований: медицинских; биологических; фармацевтических; химических. Благодаря точным результатам, которые появляются на экране оборудования, доктор может узнать характеристику реагентов и назначить пациенту эффективное лечение.

Закон Бугера Ламберта Бера

Чтобы закон полностью выполнялся, должны соблюдаться следующие условия:

Излучение должно быть монохроматическим, т.е. длина волны должна быть одинаковой, ей будут просвечивать раствор и взвесь.
Молярный коэффициент поглощения (ε) зависит от преломляющих свойств сред – как взвеси, так и раствора. Если преломление во взвеси сильнее, то линейный закон не применим. Чем больше коэффициент ε, тем более чувствительным будет метод в данном определении.
Во время измерений должна быть постоянная температура окружающей среды. Допустимо изменение только в пределах пары градусов.
Применяться должен только параллельный пучок света.
В процессе измерения спектрофотометром концентрация (с) анализируемого вещества не должна меняться вследствие изменения природы исследуемого вещества. Например, во взвеси не должны молекулы переходить в ионы, в результате диссоциации или кислотно-основной реакции.
Стараться избегать возбуждения электронов в атоме (иногда такой способ тоже применяют для анализа, но в классическом применении его избегают), то есть не облучать атомы энергией свыше шестидесяти килоджоулей.
Свет должен проходить одинаковый путь (l) при измерении раствора и взвеси.
В качестве раствора часто применяют дистиллированную воду.

Преимущества, достоинства и недостатки спектрофотометров

Спектрофотометры – исключительно чувствительные приборы, позволяющие обнаруживать следовые количества различных веществ. Можно применять их во многих отраслях техники, даже в системах безопасности аэропортов. Интересно, что в некоторых аэропортах мира (особенно часто – в Израиле) сотрудники безопасности отбирают пробы с багажа пассажиров и затем подвергают их анализу, в том числе и спектрофотометрическому. Это позволяет обнаруживать как следы контакта со взрывчатыми веществами, так и непосредственно взрывчатку.

Высокая чувствительность приборов накладывает определённые ограничения на их работу, ведь малейшие примеси будут влиять на точность и «чистоту» аналитических данных.

Основными достоинствами таких приборов, все-таки, следует считать высокую чувствительность и селективность анализов, а также способность работать как с жидкими, так и твёрдыми образцами, их сравнительную простоту, надёжность, долговечность и относительную дешевизну.

Главными недостатками спектрофотометрии следует обозначить подверженность влиянию примесей на точность анализа, невозможность анализа веществ, по которым не существует литературных данных (не установлены спектры поглощения), достаточно высокие требования к квалификации оператора в случае нестандартных примесей и загрязнений, поскольку их установление может быть затруднено, а также сравнительно трудоёмкую пробоподготовку при работе с прибором.

Спектрофотометры, как и многие другие приборы для химического анализа, имеют нишевое применение, обусловленное совокупностью их свойств. Без них невозможно представить современные биохимические и фармакологические производства и лаборатории, также, как и металлургические предприятия. Преимущества спектрофотометрии многократно перевешивают её недостатки, что и обуславливает популярность и распространённость этого метода анализа.

Особенности спектрофотометров

Самые первые фотометры нуждались в участии медицинского работника для проведения исследования. Специалист должен был сравнивать и фиксировать полученные с устройства показатели. Данные сопоставлялись с общепринятыми нормативами. На смену таким приборам пришли автоматизированные фотоэлектроколориметры.

Спектрофотометры – это современное медицинское оборудование, которое предназначается для изучения и анализа свойств предметов либо веществ с помощью электромагнитного излучения. Световые лучи проходят сквозь пробу или отражаются от нее. Прибор сравнивает поток света, который первоначально направляется на биоматериал с излучением, проходящим сквозь образец либо отражающим от его поверхности.

Для проведения анализа сканируется широченный диапазон волн: начиная от 160 нм (ультрафиолет), заканчивая 3300 нм (инфракрасные лучи), с помощью чего получается максимально точная информация о веществе.

Спектрофотометрическая методика основана на том, что каждый предмет обладает особенными спектральными характеристиками. Именно поэтому во время проведения анализа не играет роли температурный режим и агрегатное состояние образца. Особенностью спектрофотометра является возможность проведения качественных и количественных исследований.

Главным плюсом фотоэлектрического фотометра есть вывод полученной информации на дисплей (лаборант может увидеть состав пробы, наличие и численность примесей). С помощью специальных световых фильтров устройство определяет в образце не менее 3-5 составляющих компонентов.

Устройства спектрофотометры

Принцип работы и схема прибора

Спектрофотометры имеют множество вариантов конструкции. В современном мире ИК-спектрометры зачастую используют технологию частичного пропускания ИК-излучения для получения информации о составе образцов. Принципиальная схема такого прибора приведена на рис. 4. Принцип работы такого прибора заключается в измерении степени поглощения ИК-излучения образцом, находящимся между источником излучения и детектором. Отдельно стоит отметить, что современные Фурье-спектрометры используют сложную оптическую систему (интерферометр Майкельсона), разделяющий потоки излучения и создающий интерференционную картину при помощи этого. Подвижное зеркало позволяет создать необходимую для исследования разность хода лучей, что приводит к получению сложной картины – интерферограммы, которая затем претерпевает Фурье-преобразование и становится ИК-спектрограммой.

Приборы, работающие в видимой и УФ-части спектра, обладают несколько иным принципом действия. Существует две основных схемы таких приборов, с разным расположением монохроматора. Эти схемы приведены на рис. 5 и рис. 6. Принцип их работы заключается в сравнении отраженного пучка излучения от исследуемого образца и от стандартного образца, оптическое поглощение которого принято считать равным нулю. По разности интенсивности пучка излучения можно судить об оптической плотности исследуемого вещества, а затем, в соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера, становится возможным установление концентрации исследуемого вещества. За качественное определение в таком случае отвечает длина волны, при которой происходит поглощение света.

Оценка чувствительности аппаратов

Спектрофотометры обладают достаточно высокой чувствительностью. Из-за особенностей и требований метода анализа спектрофотометры зачастую настраиваются по-разному для различных испытаний, поэтому их чувствительность незначительно изменяется. Основными параметрами для этих оптических приборов служат ширина полосы пропускания, аппаратная функция установки и разрешающая способность установки. Аппаратная функция лишь показывает степень отклонений, вносимых в измерения самим прибором, когда как разрешающая способность и ширина полосы пропускания могут изменяться и зависят от параметров монохроматора, источника излучения и их сочетания.

Производная спектрофотометрия

В производной спектрофотометрии исходные спектры поглощения (нулевого порядка) преобразуются в спектры производных первого, второго и более высокого порядков.

Спектр первой производной представляет собой график зависимости градиента кривой поглощения (скорость изменения оптической плотности от длины волны, dA/dλ) от длины волны.

Спектр второй производной представляет собой график зависимости кривизны спектра поглощения (d2A/dλ2) от длины волны. Вторая производная при любой длине волны связана с концентрацией следующим соотношением:

где:

А– оптическая плотность при длине волны λ;

– удельный показатель поглощения при длине волны λ;

с– концентрация вещества в растворе, в граммах/100 мл;

l– толщина слоя, в сантиметрах.

Производная спектрофотометрия может быть использована как для целей идентификации веществ, так и для их количественного определения в многокомпонентных смесях, а также в тех случаях, когда имеется фоновое поглощение, вызванное присутствием веществ, содержание которых не регламентируется.

Приборы

Используют спектрофотометры, отвечающие указанным выше требованиям и оснащенные аналоговым резистивно-емкостным дифференцирующим модулем или цифровым дифференциатором, или другими средствами получения производных спектров, в соответствии с инструкцией к прибору. Некоторые методы получения спектров второй производной приводят к смещению длин волн относительно исходного спектра, что следует учитывать там, где это необходимо.

Разрешающая способность

Если указано в фармакопейных статьях, записывают спектр второй производной для раствора 0,2 г/л толуола в метаноле, используя метанол в качестве раствора сравнения. На спектре должен присутствовать небольшой отрицательный экстремум, расположенный между двумя большими отрицательными экстремумами при 261 нм и 268 нм, в соответствии с рис. 1. Если нет других указаний в фармакопейных статьях, отношение А/B должно быть не менее 0,2.

Методика

Процедура анализа аналогична применяемой в обычной спектрофотометрии, но вместо оптических плотностей используют производные. Готовят раствор испытуемого образца, настраивают прибор в соответствии с инструкцией производителя и рассчитывают количество определяемого вещества, как указано в фармакопейной статье.

Рисунок 1 – Спектр второй производной раствора толуола (0,2 г/л) в метаноле

Скачать в PDF ОФС.1.2.1.1.0003.15 Спектрофотометрия в УФ и видимой областях

Техническая часть спектрофотометрического метода

Спектрофотометрическое исследование требовательно относится к подготовке растворов, как окрашенных, так и чистых. Для того чтобы производить измерения спектров, используют спектрофотометр и фотоколориметр, в которые помещают исследуемые растворы.

Основные части спектрофотометра:

источник излучения,
монохроматор (если источник света не может дать монохроматический луч),
кювета, в которую размещаются растворы и взвеси,
измерительный прибор.

Основные части расширяются: 1 призмами, зеркалами и линзами, чтобы добиваться параллельности света, 2 клиньями и диафрагмами, которые выравнивают интенсивность световых лучей.

Получить монохроматический свет можно следующими источниками света:

непрямым солнечным светом,
галогенными лампами,
лазером,
штифтом Нернста,
лампой накаливания,
глобар штифт,
флуоресцентным излучением.

Спектрофотометрическое измерение, как описано выше, требует подбора нужной оптической линии. Для изготовления штифта Нернста (шН) применяют оксиды редкоземельных Me, которые плотно спрессовывают между собой в столбец. Глобар (Г) получают спрессовыванием в столб, карбида кремния. Когда через них пропускают ток, то они выдают световое излучения с соответствующими длинами волн: шН – от 1,6 до 2,0 мкм или от 5,6 до 6,0 мкм; Г – от 2 до 16 мкм.

Разделяют светофильтры на:

Абсорбционные
Интерференционные
Интерференционно-поляризационные

В качестве приемников интенсивности световых лучей или рецепторов используют фото-умножители и фотоэлементы. Характеризуют рецепторы по двум свойствам: спектральная и интегральная чувствительность. Первая характеристика – умение различать разные оптические линии, интегральная чувствительность – умение реагировать на сплошной поток света.

Для измерений в области ИК, излучения используют термоэлементы, которые делают из термо-ЭДС или термопары, и болометр. Последний изменяет сопротивление материала при воздействии на него температурой: термоэлемент встроен в мостовую схему, инфракрасное излучение вызывает нагревание этого элемента и разбаланс моста.

Спектрофотометрический анализ включает в себя построение градуировочной характеристики по известным образцам, чтобы вывести зависимость C=f(D), соотнесение полученных результатов в последующем. Когда градуировочная характеристика определена, то порядок измерения такой: 1 раствор (является основой при измерениях) — его измерение, 2 добавление в раствор исследуемого вещества,3 добавление красителя. В этом случае, степень окраски взвеси должна прямо зависеть, от концентрации исследуемого вещества, 4 измерение в спектрофотометре окрашенного раствора. Иногда в спектрофотометр вбиты соответствующие базы, и тогда метод не требует градуировочных образцов.

Возможности и область применения спектрофотометров

Медицина и фармацевтика

Высокая чувствительность приборов к наличию посторонних веществ, а также способность устанавливать, что в исследуемой пробе происходят химические реакции обусловили применение спектрофотометров в медицинских и фармацевтических целях. Для многих лекарственных препаратов известны их спектры поглощения, поэтому процесс проверки чистоты образцов сводится лишь к сравнению получаемых в процессе исследования спектрограмм, что позволяет ускорить процесс контроля качества и сделать его более точным. Также, чувствительность прибора позволяет производить оценку многих проб на предмет происходящих изменений в них, что находит своё применение в ряде медицинских анализов.

Анализ пищи и питьевой воды

Также, как и с медициной, высокая чувствительность приборов позволяет устанавливать наличие малых количеств примесей в исследуемых образцах, что положительно влияет на качество и скорость анализа. Особенно ценным представляется способность спектрофотометров к обнаружению примесей тяжёлых металлов в анализируемых образцах.

Изучение неизвестных веществ

Изучение неизвестных веществ при помощи спектрофотометрии позволяет с высокой точностью определять состав исследуемой пробы. ИК-спектроскопия является важным и часто используемым аналитическим методом в процессе синтеза новых веществ и критически важна для качественного и количественного описания продуктов синтеза.

Металлургия и химпроизводство

Способность спектрофотометров работать с твёрдыми и жидкими пробами приводит к незаменимости этих приборов на металлургических и химических производствах. Спектрофотометрия – один из ведущих неразрушающих методов установления состава сплавов и их контроля. Он также широко применяется на нефтегазохимических производствах при оценке чистоты сточных вод.

Полиграфия, печать цветной графики

Поскольку спектрофотометры используют монохроматический свет, они находят применение в полиграфии и при работе с цветной графикой. Приборы способны с высокой точностью определять цвета и используются для проведения точечных и автоматических анализов, результаты которых нужны для создания максимально точных профилей работы печатного оборудования в соответствии со стандартами ICC – международного консорциума по цвету. ICC был создан в 1993 году такими лидерами индустрии, как: Apple, Agfa, Adobe, Kodak, Microsoft, Silicon Graphics, Sun Microsystems и Taligent.

Определение состава сточных и природных вод

Высочайшая чувствительность метода позволяет определять даже мизерные, следовые количества многих веществ. В работе, связанной с анализом сточных и природных вод, это свойство спектрофотометров делает приборы незаменимыми при обнаружении наиболее опасных примесей. Примером очень опасных примесей могут служить металлоорганические соединения ртути. Именно этот класс веществ ответственен за возникновение у человека такой болезни как синдром Минамата. В 1956 году в японской префектуре Кумамото было обнаружено высокое содержание метилртути – опасного даже в минимальных количествах нейротоксичного яда. Его нахождение в воде было обусловлено сбросом в океан неорганической ртути и её соединений, которая затем встраивалась в метаболизм микроорганизмов. В связи с кумулятивностью этого яда, его содержание росло вместе с ростом его носителя в пищевой цепочке. В устрицах залива Минамата содержалось до 85 мг/кг этого соединения, тогда как концентрация его в воде составляла всего лишь 0,6-0,7 мг/л.

Теоретически использование такого чувствительного и селективного метода, как спектрофотометрия, могло бы позволить обнаружить даже незначительные количества метилртути в образцах воды из залива. Таким образом, спектрофотометрия выступает важным методом анализа и оценки сточных вод.

Правила выбора спектрофотометра

При подборе устройства необходимо учитывать сферу его применения и выполняемые задачи. Фотоэлектрические фотометры бывают переносными и стационарными. Портативные аппараты имеют небольшой вес, компактные и легкие в использовании. Стационарные приборы устанавливаются в медицинских учреждениях и диагностических центрах. С помощью этих устройств проводятся более сложные измерения. Такие спектрофотометры могут подключаться к персональному компьютеру с помощью кабеля, а полученные данные подлежат архивированию, обработке и распечатке на принтере.

При выборе медицинского аппарата нужно учитывать: спектр действия (диапазон); длину волны; многофункциональность устройства; габариты; цену; вероятность проведения определенных исследований; количество секций для реагентов; способ получения результатов

Также необходимо обратить внимание на штатную комплектацию модели спектрометра, потому как практически все современные приборы продаются с кюветом и чашкой Петри

Больше свежей и актуальной информации о здоровье на нашем канале в Telegram. Подписывайтесь: https://t.me/foodandhealthru

Будем признательны, если воспользуетесь кнопочками:

Регистрирующие спектрофотометры СФ-10 и СФ-14

Позволяют записывать спектры поглощения и пропускания растворов. Спектры регистрируются в области видимого спектра за сравнительно короткое время (2-12 мин). Приборы имеют двойной монохроматор, поэтому монохроматизация света достигается довольно высокая, при этом автоматически вырезается (выделяется) спектральный участок постоянного интервала длин волн. Источником освещения является кинопроекционная лампа К-30, а приемником энергии — мультищелочной фотоэлемент Ф-10. Рабочий интервал охватывает область спектра от 400 до 700 нм.

Оба спектрофотометра состоят из осветителя, двойного монохроматора, фотометра поляризационного типа, приемно-усилительной части и регистрирующего механизма. На рис. 111 приведена оптическая схема спектрофотометров СФ-10 и СФ-14, состоящая из спектральной и фотометрической части. Свет лампы 1 направляется конденсором 2 через входную щель 3 в объектив 4 коллиматора. Входная щель 3 расположена в фокальной плоскости объектива. Выходящий из него пучок света проходит первый монохроматор (диспергирующую призму) 5 и разлагается в спектр. Объектив 6 первого монохроматора дает спектральное изображение выходной щели в плоскости средней щели по линии А-А. Средняя щель двойного монохроматора, образованная зеркалом 7 и ножом 8, вырезает участок спектра, который проходит второй монохроматор 5′ и проектируется в плоскости выходной щели 9.

После выхода из монохроматора 5′ пучок света попадает в фотометрическую часть прибора: сначала он проходит через линзу 10 и двояко преломляющую призму Рошона 11. Линза 10 дает изображение объектива выходного коллиматора вблизи диафрагмы 12, а призма 11 разделяет это изображение на два, поляризованных во взаимно перпендикулярных плоскостях: одно, расположенное симметрично относительно оптической оси, проходит через призму Волластона 13 и линзу 14, другое — смещенное, срезается диафрагмой 12. Линза 14 дает изображение выходной щели в плоскости полулинз 15. Вследствие двойного лучепреломления призмы Волластона в плоскости полулинз получается два изображения выходной щели. Пройдя полулинзы 15, установленные внутри барабана прерывателя 16, оба пучка отклоняются на 90° призмой 17, проходят через входные окна интегрирующей сферы 18 и падают на окна, напротив которых устанавливаются кюветы с анализируемым раствором и раствором сравнения при измерении коэффициента пропускания. Свет, отраженный от растворов, суммируется шаром и попадает на фотоэлемент, находящийся за выходным окном шара. Осветитель, электромеханическая система и усилитель питаются от сети переменного тока в 127 В.

Измерение оптической плотности

Если нет других указаний в фармакопейной статье, измерение оптической плотности проводят при указанной длине волны с использованием кювет с толщиной слоя 1 см и при температуре (20 ± 1) °С по сравнению с тем же растворителем или той же смесью растворителей, в которой растворено вещество. При измерении оптической плотности раствора при данной длине волны оптическая плотность кюветы с растворителем, измеренная против воздуха при той же длине волны, не должна превышать 0,9 и, желательно, чтобы она была не менее 0,2.

Спектр поглощения представляют таким образом, чтобы оптическая плотность или ее некоторая функция были приведены по оси ординат, а длина волны или некоторая функция длины волны – по оси абсцисс.

Если в фармакопейной статье для максимума поглощения указывается только одна длина волны, то это означает, что полученное значение максимума не должно отличаться от указанного более чем на ± 2 нм.