Определение протопластов, применение и культура протопластов

Реверсия протопластов

Протопласты обладают способностью к реверсии в исходные бактериальные формы. Эффективнее всех реверсируют протопласты, полученные из бактерий, находящихся в ранней фазе роста .

Реверсия усиливается при добавлении в регенерационную среду дрожжевого экстракта, аминокислот, входящих в состав клеточной стенки, сыворотки, замена агара желатином в твердой среде .

При реверсии протопластов, в начале может наблюдаться увеличение размеров, затем образование рыхлой, в последствии уплотняющейся клеточной стенки. Одновременно наблюдается формирование поперечных связей в пептидогликане. Это придает ригидность клеточной стенке. Отмечается, что реверсировавшиеся протопласты способны к делению .

Подготовка к приему контрольных тестов на выносливость кратко
Нормы права история и современность кратко
Сигнальные белки это кратко
Церковь и государство кратко
Объективный идеализм и рационализм г лейбница кратко

Получение в лабораторных условиях

Протопласты получают в лабораторных условиях путем обработки клеток бактерий лизоцимом (разрушает муреин), антибиотиками пенициллинового ряда, циклосерином (подавляет синтез муреина) .

Лизоцим действует на β-1,4-гликозидные связи муреина, что и является причиной разрушения муреина у бактерий со сформировавшейся клеточной стенкой .

Антибиотики пенициллинового ряда и циклосерин действуют только на растущие бактерии. Они нарушают синтез муреина клеточной стенки, препятствуя поперечной сшивке пептидогликановых цепей и образованию пептидных связей .

Протопласты получают с помощью других ферментов, разрушающие пептидные связи, участвующие в поперечной сшивке гетерополимерных цепей муреина .

Получение

Изображение флуоресцентной микроскопии: протопласт лука-порея, грудная клетка которого не полностью переварена. Действительно, правый край остается прямолинейным, тогда как ячейки без стенок имеют характерную круглую форму.

Протопласты обычно получают ферментативным расщеплением стенки, в частности, с помощью таких ферментов, как пектиназа , целлюлаза или лизоцим . Из-за осмотического давления растительные клетки обычно имеют ограниченную форму. Удаление стенки позволяет протопластам принимать сферическую форму .

Пищеварение происходит в гипертонической среде, потому что растительные клетки, лишенные пектоцеллюлозного «каркаса», рискуют лопнуть. Таким образом, полученная среда (жидкость) обычно обогащена неметаболизируемыми углеводами, такими как маннит или инозит . Другие углеводы или минеральные соли могут использоваться для уменьшения активности воды (см. Также осмос ) внеклеточной среды с внутриклеточной средой. Плазмолиз растительных клеток также позволяет «от» плазматической мембраны клеток в стенке. Это защищает клетки от фрагментов целлюлозы, которые могут проколоть протопласт во время пищеварения.

Полученные таким образом клетки чрезмерно хрупкие

С суспензией протопластов обращаются с большой осторожностью, потому что простой факт нанесения удара по чашке или аспирации содержимого пипеткой вызывает гибель клеток за счет разрыва плазматической мембраны. Можно оценить количество протопластов, полученных в растворе, путем подсчета под оптическим микроскопом с использованием предметного стекла Кова или клетки Малассеза .

У бактерий протопласт является результатом действия либо лизоцима на бактерии в состоянии покоя или в процессе роста, либо пенициллина на бактерии в процессе роста. Затем стержни становятся сферическими, поскольку они теряют жесткость, придаваемую им пептидогликаном.

Поглощение макромолекул, вирусов и органелл протопластами

Протопласты способны поглощать органеллы, чужеродные вещества и другие молекулы посредством процесса фагоцитоза. Это продемонстрировало, что одна клетка восприимчива к заражению более чем одной вирусной частицей и что разные вирусы могут реплицироваться в одной клетке. Кроме того, протопласты были трансформированы с использованием Ti-ДНК из Agrobacterium Tumefaciens, которые можно было использовать для использования в генной инженерии. Поглощение пластидами позволяет исследовать взаимодействие как с ядерными, так и с геномами пластид. Поглощенные чужеродные гены также могут компенсировать отсутствие дефектов в геноме этого протопласта. Слияние протопластов, которые были инактивированы у физалиса и дурмана, придало нитратредуктазную активность мутантной форме Nicotiana tabacum, в которой отсутствует нитратредуктаза. Трансформация оказалась стабильной.

Современные методы анализа, такие как гель-электрофорез и свидетельство активности ферментов в геле или изоферментов, доказывают эффективность исследований слияния. Рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза служит маркером со значительной целью, поскольку состоит из субъединиц, кодируемых ядерными и пластидными. Кроме того, он обеспечивает изучение этого белка для получения информации о функциях пластид, а также ядра родительских видов в продукте слияния.

После того, как методы протопластов были созданы, жизненно важным стало создание, а затем изоляция мутантов. Особое значение имели ауксотрофные виды, т. е. штаммы, зависящие от наличия определенных питательных веществ. Было получено очень мало результатов. Одна из причин может быть связана с тем, что значительная часть геномов покрытосеменных является полиплоидной и что генетическая информация присутствует во многих копиях, даже в гаплотипах. Это может быть легко компенсировано недостатком гена. Кроме того, растения способны производить один и тот же продукт посредством различных метаболических путей. Одним из возможных решений проблемы может быть использование моногаплоидных штаммов (1 x вместо 1 n). Если это относится к культурным сортам, значит ли это, что исходные растения должны быть обнаружены в первую очередь.

Что такое Протопласт?

Протопласт — это тип клетки, которая может быть растительной, бактериальной или грибковой, клеточная стенка которой полностью или частично разрушена. Разложение осуществляется с помощью механических или ферментативных воздействий. Клеточные стенки состоят из различных полисахаридов. Следовательно, его разложение зависит от ферментов, которые способны разлагать полисахаридные компоненты. Для этого задействованы разные ферменты. Клеточные стенки растений могут быть разрушены типами ферментов, которые включают целлюлазу, пектиназу и ксиланазу. В контексте деградации клеточной стенки бактерий и грибов участвуют ферменты, такие как лизоцимы и хитиназы, соответственно. Во время деградации клеточной стенки клетка подвергается высокому осмотическому стрессу. Следовательно, чтобы предотвратить разрыв клеточной мембраны из-за высокого осмотического давления, деградацию клеточной стенки следует проводить в изотоническом растворе.

Протопласты могут быть использованы для исследования мембранной биологии и сомаклональных вариаций. Сомаклональная вариация используется для наблюдения за вариациями в растениях, полученных с помощью культуры тканей растений. В мембране биологические протопласты используются для идентификации различных путей, которые используются для поглощения макромолекул, а также для обнаружения различных типов вирусов. Технология трансформации ДНК широко использует протопласты. Это связано с тем, что у этих клеток отсутствует клеточная стенка и, следовательно, они способствуют перемещению ДНК в клетку без какой-либо блокировки. При регенерации растений также широко используются протопласты. Изначально они превращаются в группу растительных клеток, которая позже превращается в каллусы. В контексте селекции растений протопласты участвуют в методе, называемом слиянием протопластов.

Свойства протопластов

Кроме того, протопласты характеризуются следующими свойствами:

протопласты в 3–10 раз крупнее исходных клеток бактерий;
в гипертонических и изотонических условиях протопласты осуществляют обмен веществ, характерный для исходных клеток: сохраняют дыхательную активность, синтезируют необходимые биополимеры, образуют эндоспоры (если был инициирован процесс споруляции);
иногда может наблюдаться рост протопластов, а иногда и их деление;
в отличие от исходных клеток, на протопластах не адсорбируются бактериофаги и бактериоцины;
у протопластов отсутствуют мезосомы – производные цитоплозматической мембраны;
при снятии фактора, действующего на образование муреина, протопласты обычно отмирают, иногда регенерируют клеточную стенку и возвращаются в исходное состояние или превращаются в L-формы .

См. также

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое «Протопласт» в других словарях:

протопласт — протопласт … Орфографический словарь-справочник

ПРОТОПЛАСТ — (от прото. и греческого plastos вылепленный, образованный), содержимое растительной клетки; состоит из клеточной мембраны, цитоплазмы и ядра, но не включает внешнюю клеточную оболочку. Протопласт получают искусственно для клонирования и… … Современная энциклопедия

Протопласт — (от прото. и греческого plastos вылепленный, образованный), содержимое растительной клетки; состоит из клеточной мембраны, цитоплазмы и ядра, но не включает внешнюю клеточную оболочку. Протопласт получают искусственно для клонирования и… … Иллюстрированный энциклопедический словарь

ПРОТОПЛАСТ — (от прото. и греч. plastos вылепленный образованный), содержимое растительной клетки; состоит из клеточной мембраны, цитоплазмы и ядра, но не включает внешнюю клеточную оболочку. Протопласты получают искусственно для их клонирования и… … Большой Энциклопедический словарь

ПРОТОПЛАСТ — ПРОТОПЛАСТ, у растений КЛЕТКА, полностью лишенная клеточной стенки и имеющая только клеточную мембрану, которая ограничивает ЦИТОПЛАЗМУ с ЯДРОМ и другими ОРГАНОИДАМИ. см. также ПРОТОПЛАЗМА … Научно-технический энциклопедический словарь

ПРОТОПЛАСТ — (от прото. и греч. plastos вылепленный, образованный), у растений клетка, полностью лишённая клеточной стенки и имеющая только клеточную мембрану, к рая ограничивает цитоплазму с разл. органоидами и др. включениями. П. растений получают… … Биологический энциклопедический словарь

протопласт — сущ., кол во синонимов: 1 • клетка (126) Словарь синонимов ASIS. В.Н. Тришин. 2013 … Словарь синонимов

протопласт — (от прото. и греч. plastós вылепленный, образованный), содержимое растительной клетки; состоит из клеточной мембраны, цитоплазмы и ядра, но не включает внешнюю клеточную оболочку. Протопласт получают искусственно для клонирования и регенерации … Энциклопедический словарь

Протопласты – это бактериальные клетки, округлой формы, полностью лишенные клеточной стенки и окруженные только цитоплазматической мембраной. Их можно получить из любой бактериальной клетки .

Клеточная стенка бактерий может быть удалена в определенных условиях. В этом случае грамположительные бактерии образуют обычно протопласты, а грамотрицательные – сферопласты. Не исключено получение протопластов из грамотрицательных бактерий, а сферопластов – из грамположительных. Бактерии без клеточной стенки существуют и в природе. Они относятся к классу Микоплазмы (Mollicutes) .

Определение протопласта

Протопласты — это клетки растений, которые полностью обнажены и не имеют клеточной стенки, однако у них есть плазматические мембраны и другие компоненты клетки. Это функциональные клетки, но без наличия барьера, клеточной стенки. Протопласты разных видов могут быть объединены для создания гибрида, и это известно как соматическая гибридизация (или слияние протопластов). Цибридизация — это процесс слияния протопластов нормального размера с ядросодержащим (безъядерным) протопластом, в результате чего образуется цибрид, также известный как цитопласт (цитоплазматические гибриды).

Термин «протопласт» был введен в 1880 году Ганстейном. Первый протопласт был выделен Клеркером (1892 г.) механическим методом. Первый настоящий прорыв в исследованиях протопластов был достигнут в 1960 году Кокингом, который применил ферментный метод для устранения клеточных стенок.

Ракабе и его сотрудникам (1971) удалось создать целые растения табака из протопластов. После 1980 г. произошел быстрый прогресс в слиянии протопластов с пропластами, что улучшило генетический материал, а также создание трансгенных культур.

Немного истории

В биологическую терминологию термин вошел в 1880 году благодаря великому немецкому ботанику-микробиологу Иоганнесу Людвигу Эмиль Роберту фон Ханштайну (1822-1880). Именно его работы положили начало целой отрасли ботаники — эмбриологии растений. С тех пор биоинженерная индустрия шагнула далеко вперед. Слиянием протопластов первый гибрид двух видов табака получил американский биолог Питер Карлсон в 1972 году. Но только в 1985 году впервые были зарегистрированы мутантный сорт риса Мицуи байосаса №1 и сорт риса Хацуюми поздний, селекционированные японскими биологами с использованием протопластов.

Несколько удивительных фактов

Ученые работают над перенесением в клубнику или яблоки гена африканского растения Dioscoreophyllum cumminisii, который отвечает за синтез белка в тысячи раз слаще сахарозы. Так как за сладость в данном случае отвечает белок, а не углевод, это поистине находка для всех людей, страдающих диабетом.

Голубые хризантемы и розы, зеленые лилии, фиолетовые тюльпаны – цветы, которые сегодня уже никого не удивляют. Арктические яблоки апельсины – пока еще в диковинку.

Уже есть тополя, которые удаляют из раствора до 91 % трихлорэтилена, а это главный компонент загрязнения подземных вод. Ученые работают над выведением растений, которые смогут поглощать больше углерода из воздуха и хранить их в корнях – это должно снизить скорость развития парникового эффекта на планете.

А вот болезни мы будем лечить, кушая бананы. Уже есть исследования, доказывающие, что при введении в молодое дерево измененного возбудителя болезней, клетки дерева синтезируют белки этого вируса. Таким образом, откусив такой банан можно считать, что вы ввели себе вакцину от данного заболевания.

Золотой рис, в отличие от обычного, содержит углевод бета-каротин, как в моркови. Для людей, где в пище отсутствует витамин А (незаменимые аминокислоты), это просто находка.

Пентагон (США) в 2003 году наградил биотехнологов, которые вывели сорт сосны, меняющей цвет при контакте с отравляющими химическими веществами биологического и антропогенного характера.

Все достижения науки приносят людям как пользу, так и влекут за собой долгосрочные изменения в экосистеме планеты. Именно поэтому во всех странах так много законодательных актов и институтов, контролирующих данную отрасль. В России базой исследований и контролем их результатов является Федеральное учреждение «Институт общей генетики им.Н.И.Вавилова» РАН в Санкт-Петербурге. А с 1 июля этого года введена обязательная регистрация всех генно-модифицированных организмов и продукции в соответствии с законом РФ№358 от 03.07.2016. Изменяя природу, нам необходимо помнить о том, что ею все уже придумано и сбалансировано задолго до нас и нашего появления на этой планете

Осторожность в действиях — приоритет и девиз современной генной инженерии

Просмотры: 43

Изолирование протопластов

Существует несколько способов выделения протопластов. Это:

Механический – клеточную стенку разрезают, а протопласт выходит в среду. Современные механические способы довольно разнообразны, но все они имеют недостатки: низкая производительность, это высокотрудоемкий и длительный процесс.
Энзиматический – выведение протопласта происходит при помощи ферментов (целлюлаза, гемицеллюлаза, пектиназа). В таком случае протопласт не повреждается и не обезвоживается. Это быстрый и производительный способ (из 1 грамма ткани выделяют до 10 миллионов протопластов).

Данный процесс делится на три этапа: ферментативную обработку, собственно выделение протопластов и разделение их с поврежденными остатками.

Особенности и качества

Специфические свойства растительной клетки без оболочки важны для растения в процессах митоза и мейоза. Только при отсутствии оболочки происходит деление клеток и их дифференциация в структурные компоненты тканей. Особенность протоплазматической клетки – ее тотипотентность (множественные возможности). Протопласты клетки способны к регенерации оболочки, а при делении образуют каллус (группа дедифференцированных клеток), формируя целый организм. Кроме того, протопласт — это активно обменивающаяся со средой структура (белками, липопротеинами и нуклеиновыми кислотами). Эти особенности протопластов и используют биотехнологи и генные инженеры.

Что такое протопластная культура?

Принцип культивирования протопластов заключается в асептическом удалении большого количества здоровых протопластов путем удаления их клеточной стенки для их культивирования в подходящей среде, богатой питательными веществами, для поддержки их развития и роста.

Протопласт выделяется различными тканями растений. Хорошим и удобным источником является мезофилл листа, а также клетки, выращенные в жидких суспензионных культурах. На жизнеспособность и урожайность протопластов сильно влияет состояние растения и клеток.

Наиболее важным шагом в выделении протопластов является удаление клеточной стенки без повреждения протопластов или клетки. Растительные клетки представляют собой осмотическое устройство. Клеточная стенка оказывает восходящее давление на протопласты в корпусе. Точно так же протопласт оказывает равное или противоположное давление на стенку клетки.

Следовательно, оба давления равны. Если вы уберете стенку вашей камеры, то у вас уберут и уравновесят давление. Это означает, что давление наружу протопласта будет увеличиваться и одновременно без клеточной стенки происходит непреодолимое расширение протопласта из-за массивного оттока воды из внешнего источника.

Большее давление наружу и расширение протопласта вызывают его взрыв. Таким образом, выделенный протопласт представляет собой осмотически хрупкую и хрупкую структуру, когда он находится в своей младенческой стадии.

Таким образом, когда клеточная стенка удаляется для выделения протопластов, клетки или ткани должны быть помещены в гипертоническую жидкость из сахаров, которые метаболически инертны, такие как маннитол в большей концентрации (13 процентов), чтобы помочь плазмолизу клеток прочь от его поверхности. клеточные стенки.

Маннитол, спиртовой сахар, который легко переносится через плазмодесмы. Он создает стабильную осмотическую среду для протопластов и препятствует нормальному расширению и разрыву протопластов даже после удаления клеточной стенки. По этой причине гипертоническое вещество также известно как осмотический стабилизатор, также известный как плазмолитик или осмолитик.

Когда клетки стабилизируются таким образом путем плазмолиза, протопласты высвобождаются из своей клеточной стенки, заключенной в нее, либо механически, либо ферментативно. Механическая изоляция требует разрушения стенок каждого клеточного компартмента, чтобы освободить протопласт.

Процедуру можно проводить с осторожностью на небольших участках ткани под микроскопом с помощью микроскальпеля. Однако очень немногие протопласты могут быть получены с большими затратами энергии и времени

Самые обширные попытки механической изоляции включают дезинтеграцию ткани с использованием тонкой щетки с щетиной из нержавеющей стали.

Этот метод может высвободить больше протопластов с меньшими усилиями, однако процент выхода неповрежденных протопластов остается низким. Более эффективным методом освобождения протопластов является переваривание клеточных стенок, которые их окружают, с использованием разрушающих клеточные стенки ферментов, таких как целлюлаза или гемицеллюлаза. мацерозим, пектиназа и так далее. Эти ферменты выделены из грибов и могут быть приобретены на рынке.

Продолжительность обработки и концентрация ферментов являются наиболее важными факторами, и оба они должны быть определены для каждой ткани растения. Интактную ткань можно обработать раствором мацерозима или пектиназы, которые растворяют средний слой между клетками и, таким образом, разделяют их.

Ожидается, что последующая обработка целлюлазой удалит целлюлозные слои клеток. Этот процесс называется последовательной обработкой ферментами или двухэтапной обработкой вместо смешанной обработки (одностадийной процедуры), когда и мацерозим, и целлюлаза объединяются, так что вся стенка может быть разрушена в одном процессе.

Выделенные протопласты можно выращивать в статической жидкости или в агаризованной среде. Среда протопластов состоит из минералов и источников углерода, витаминов и гормонов роста растений и стабилизаторов осмотической природы и, возможно, источников органического азота, таких как кокосовое молоко и органические кислоты. В культуре протопласты могут создавать внутри себя новую клеточную стенку. Когда создается стенка, протопласт превращается в настоящую клетку.

Затем клетки протопласта начинают делиться на клетки, за которыми следует образование каллюса и клеток. Эти каллюсы также обладают потенциалом для морфогенеза и регенерации растений.

Объект конструирования

Областями применения изолированных протопластов в биотехнологиях включают теоретический и практический аспекты, а именно:

Позволяют изучать структуру и химию самой клеточной стенки при ее разрушении и синтезе.
С их помощью изучают свойства плазмалеммы и характер трансмембранного транспорта.
Возможность мягкого выделения органелл клетки и их изучения.
Изучение дифференциации тотипотентных клеток, взаимодействий ядра и гиалоплазмы.
Получение и изучение соматических гибридных клеток.
Введение чужеродных органелл в структуру клеток.
Изучение механизма трансгенеза (введения чужих генов).

использовать

Протопласты часто используются в экспериментах с растениями. У них очень разнообразные области применения, потому что их легко получить, а отсутствие стены позволяет применять самые разные методы лечения. Однако регенерировать целое растение из протопластов часто бывает очень сложно .

Слияние протопластов и получение гибридов

Изображение флуоресцентной микроскопии: два протопласта слияния салата ягненка. Благодаря присутствию в среде полиэтиленгликоля (ПЭГ) сближение клеток может происходить, несмотря на электростатическое отталкивание мембран. ДНК окрашена в синий цвет флуорохромом: DAPI. Хлорофилл отображается красным цветом.

Протопласты позволяют, например, сливать клетки двух видов или даже разных видов. Такая операция дает возможность получать гибриды . Слияние так называемых «выносливых» диких видов (устойчивых к стрессу) с видами, представляющими агрономический интерес, позволяет, например, получить особей, сочетающих характеристики устойчивости и продуктивности. Эта стратегия очень часто применяется к растениям семейства Solanaceae и Brassicaceae . Слиянию могут способствовать химические вещества (например, ПЭГ ), которые уменьшают электростатическое отталкивание между протопластами, или приложение электрического поля к суспензии клеток.

Генетическая трансформация протопластов

Протопласты также упрощают генетическую трансформацию. Для прямого введения фрагмента ДНК в клетки используется электропорация , что невозможно при наличии грудно-целлюлозной стенки.

Производство вторичных метаболитов

Крупномасштабное культивирование растительных клеток сделало возможным промышленное производство представляющих интерес вторичных метаболитов. К ним относятся винбластин и винкристин , два алкалоида, производимые мадагаскарским барвинком ( Catharanthus roseus ) и используемые для лечения некоторых видов рака. Низкое содержание алкалоидов в листьях (соответственно менее 10 г и 1 г на тонну свежих листьев) приводит к колоссальным затратам на добычу. Культура растительных клеток потенциально снизила бы стоимость производства этих молекул в 25 раз (первоначально 25 000 000 долларов за грамм алкалоидов).