Питательная среда

Бактериальные культуральные среды

Культуральной средой называют твердый или жидкий препарат, используемый для выращивания, транспортировки и хранения микроорганизмов.
Все микроорганизмы нуждаются в источниках энергии, макро- и микроэлементах, точный состав удовлетворительной среды зависит от культивируемых видов из-за большого разнообразия потребностей в питательных веществах.
Чтобы быть эффективной, культуральная среда должна содержать все питательные вещества, необходимые микроорганизму для роста.
Часто среда используется для отбора и выращивания конкретных микроорганизмов или для идентификации конкретных видов.
Среда также может быть специально разработана для облегчения роста одного типа микробов, присутствующих в природном образце.

Сыворотка в СМИ

Сыворотка содержит разнообразную смесь факторов роста, альбуминов, а также ингибиторов роста [3232–2. Сыворотка является одним из основных элементов среды для культивирования клеток и является источником аминокислот, а также белков, а также витаминных добавок (особенно жирорастворимых витаминов, таких как D, D, E и K), углеводов и липидов, гормонов, фактор роста, минеральные и микроэлементы. Сыворотка телят и эмбрионов крупного рогатого скота обычно используется для содействия росту клеток в культуре. Эмбриональная сыворотка является богатым источником факторов, стимулирующих рост, и подходит для клонирования клеток, а также для роста прихотливых клеток. Использование телячьей сыворотки в исследованиях контактного торможения связано с ее меньшей способностью стимулировать рост. Нормальная среда для выращивания обычно содержит 10-XNUMX% сыворотки. Дополнение среды сывороткой имеет следующие преимущества:

Сыворотка обеспечивает самое основное питание (как внутри раствора, так и связанное с белками), которое требуется клеткам.

Сыворотка является источником нескольких факторов роста, а также гормонов, которые участвуют в стимуляции роста и функционировании клеток.

Он содержит множество связывающих белков, таких как трансферрин, альбумин, которые переносят различные другие молекулы в клетки. Например: альбумин переносит в клетки липиды, витамины, гормоны и т.д.
Он также обеспечивает белки, такие как фибронектин, которые способствуют адгезии клеток к субстрату. Он также поставляет факторы распространения, которые позволяют клеткам распространяться до того, как они начнут делиться.
Это ингибитор протеазы, который может защитить клетки от протеолиза.
Он также содержит минералы, такие как минералы Na+ и K+ Zn2+ и т. д.
Он улучшает вязкость среды, что, в свою очередь, защищает клетки от механических повреждений при перемешивании суспензионных культур.
Он также служит посредником.

Из-за присутствия ингибиторов, а также факторов роста функция сыворотки в процессе культивирования клеток чрезвычайно сложна. В дополнение к выполнению различных ролей использование сыворотки в контексте культуры тканей не лишено недостатков. В таблице представлены преимущества и недостатки использования сыворотки в среде.

Преимущества сывороток в средах
Недостатки сывороток в средах
Сыворотка является источником многих факторов роста, а также гормонов, которые могут стимулировать рост и функцию клеток.
Неопределенность состава и состава сыворотки
Помогает в соединении клеток
Очень важно проводить тесты, чтобы гарантировать качество каждой партии перед использованием.
Распространяет информацию о
Может содержать некоторые факторы, препятствующие росту
действует как буферный агент, который помогает поддерживать рН среды культуры
Увеличьте вероятность заражения
Выполняет роль связывающего белка
Наличие сыворотки в среде может мешать отделению и очистке продуктов от клеток.
Уменьшает механические повреждения и повреждения, вызванные вязкостью

Требование к питательным средам

Для культивирования микроорганизмов используют различные по составу питательные среды. Но все они должны соответствовать ряду общих требований:

содержать полный набор веществ необходимых для питания, выращиваемого микроорганизма, в легко усвояемой форме;
обладать оптимальной влажностью, вязкостью, кислотностью среды (pH);
быть изотоничными ( с осмотическим давлением равным осмотическому давлению внутри клетки);
по возможности – быть прозрачными.

Основные компоненты любой питательной среды – источники азота и углерода. Их количественное отношение является определяющей характеристикой большинства сред.

Автотрофные микробы требовательны к наличию углекислого газа, поскольку его концентрация в воздухе составляет только 0,03 %. Для обеспечения питательных сред углекислым газом вносят обычно карбонат кальция (СаСО₃), иногда – гидрокарбонат натрия (NaHCO₃), либо другие карбонаты. В некоторых случаях через среду продувают воздух, искусственно обогащенный углекислым газом до 1–5%.

Гетеротрофные организмы успешно развиваются на средах, содержащих источники углерода в виде органических соединений. В зависимости от индивидуальных особенностей гетеротрофные микроорганизмы используют разнообразные органические соединения – спирты, органические кислоты, углеводы, углеводороды, ароматические соединения. Обычно в лабораторной практике в качестве источника углерода применяют глюкозу, поскольку именно это соединение углерода легче всего утилизируется микробами.

Потребности в источниках азота удовлетворяются азотосодержащими соединениями, с разной степенью восстановленности азота. В основном, это соли аммония, вносимые в питательную среду в форме сульфатов и хлоридов. При использовании этих веществ необходимо учитывать их высокую физиологическую кислотность, влияющую на кислотность среды и развитие микроорганизмов. Кроме того, потребность в азоте удовлетворяется нитратами. Нитриты используются очень редко, поскольку токсичны для многих микроорганизмов.

Не маловажными для построения веществ микробной клетки являются соединения фосфора, серы, калия, магния, кальция и других элементов, которые так же должны содержаться в питательной среде в доступной форме. Их потребность удовлетворяется за счет минеральных солей.

Потребность в сере удовлетворяются сульфатами. В фосфоре – солями фосфорной кислоты. Все необходимые металлы и прочие элементы – в форме катионов или анионов неорганических солей. В частности, источник магния – сульфат магния (MgSO₄), натрия – хлорид натрия или поваренная соль (NaCl), кальция – хлорид кальция (CaCl₂) или карбонат кальция (CaCO₃).

Для нормального развития микробов, в том числе бактерий, необходимы так называемые факторы роста (аминокислоты, азотистые основания, витамины, жирные кислоты, железоприны и многие другие соединения). Их добавляют в питательные среды в значительно меньшем количестве, чем макроэлементы.

Потребность в нескольких аминокислотах удовлетворяют, добавляя гидролизат белка. Для его получения используют белки животного или растительного происхождения. В первом случае это мясо, рыба, желатин, казеин. Во втором – семена сои, подсолнечника, кукурузы. Источником аминокислот могут служить клетки микроорганизмов – дрожжи, водоросли, бактерии.

Классификация питательных сред по химическому составу

По химическому составу питательные среды для бактерий делятся на три группы:

Определенная или синтетическая среда
Сложные носители
Простые медиа

Определенная или синтетическая среда

Определенная среда, также известная как синтетическая среда, содержит известные количества всех ингредиентов.
Все используемые химические вещества известны, и он не содержит животных, дрожжей или растительных тканей.
Определенные или синтетические среды содержат микроэлементы и витамины.
Он также содержит определенный источник углерода и источник азота, необходимый для определенных микробов.
Определенная или синтетическая среда может быть в жидкой форме (бульон) или отверждена агентом, таким как агар.
Он часто используется для культивирования фотосинтезирующих микробов, использующих CO2 в качестве источника углерода и свет в качестве источника энергии.
Он содержит карбонат натрия или бикарбонат в качестве источника CO2 и нитрат или аммиак в качестве источника азота, сульфата, фосфата и других минералов.
Примером определенной или синтетической среды является среда Дюбо с Tween 80, среда B-11 для цианобактерий, среда для E. coli.

Состав среды В-11 для цианобактерий

NaNO3 – 1.5 г/л
K2HPO4.3H2O – 0.04 г/л
MgSO4. 7H2O – 0.075 г/л
CaCl2. 7H2O – 0.036 г/л
Лимонная кислота – 0.006 г/л
Цитрат железа аммония – 0.006 г/л
ЭДТА (Na2Mg Slat) – 0.001 г/л
Na2Co3 – 0.02 г/л
Раствор микроэлементов – 1.0 мл/л
Конечный рН 7.4

Среда для E. coli. Состав

Глюкоза – 1.0 г/л
Na2HPO4 – 16.4 г/л
KH2PO4 – 1.5 г/л
(NH4)2SO4 – 2.0 г/л
MgSO4. 7H2O – 0.2 г/л
CaCl2 – 0.01 г/л
FeSO4. 7H2O – 0.0005 г/л
Конечный рН 6.8-7

Сложные носители

Среды, содержащие некоторые ингредиенты неизвестного химического состава, известны как сложные среды.
Большинство сред, кроме основных сред, обычно известны как сложные среды .
Сложные среды имеют некоторые сложные ингредиенты, которые состоят из смеси многих химических веществ в неизвестных пропорциях.
Это неопределенная среда, поскольку источник аминокислот содержит множество соединений, точный состав которых неизвестен.
Они очень полезны, потому что одна комплексная среда может удовлетворить все пищевые потребности множества различных микроорганизмов.
Сложные среды часто необходимы, потому что питательные потребности конкретного микроорганизма неизвестны, и, таким образом, нельзя составить определенную среду.
Сложные среды также используются для культивирования прихотливых микробов со сложными потребностями в питании или культуре.
Большинство сложных сред содержат неопределенные компоненты, такие как пептоны, мясной экстракт и дрожжевой экстракт.
Пептоны представляют собой белковые гидролизаты, полученные путем частичного протеолитического переваривания мяса, казеина, соевой муки, желатина и других источников белка. Они служат источниками углерода, энергии и азота.
Экстракт говядины и экстракт дрожжей представляют собой водные экстракты нежирной говядины и пивных дрожжей соответственно. Экстракт говядины содержит аминокислоты, пептиды, нуклеотиды, органические кислоты, витамины и минералы.
Экстракт дрожжей является отличным источником витаминов группы В, а также соединений азота и углерода.
Примерами сложных сред являются питательный бульон, триптический соевый бульон и агар МакКонки.

Простые медиа

Простые или базальные среды включают питательный бульон и пептонную воду, которые составляют основу других сред.
Примером простых сред является питательный бульон, питательный агар.
Питательный бульон является примером простой жидкой среды, состоящей из пептона, мясного экстракта, хлорида натрия и воды. Добавление 0.5% глюкозы в питательный бульон делает его глюкозным бульоном.
Питательный агар является примером простой твердой среды. Среда обычно используется для выделения многих бактерий из клинических образцов.

Статья составлена с использованием следующих материалов:

Красникова Л.В., Гунькова П.И. Общая и пищевая микробиология: Учеб. пособие. Часть I. – СПб.: Университет ИТМО, 2016. – 134 с &nbspСкачать >>>

Литусов Н.В. Физиология бактерий. Иллюстрированное учебное пособие. – Екатеринбург: Изд-во УГМУ, 2015. – 43 с

Лысак В.В. Микробиология : учеб. пособие / В. В. Лысак. – Минск: БГУ, 2007 – 430 с

Филина Н.Ю. Верховцева Н.В. Экологическая физиология микроорганизмов. Часть 1. Физиология микроорганизмов: Учебное пособие/Ярославский государственный университет, Ярославль,2001 – 92 с

bacterial leaf spot (Xanthomonas axonopodis) Starr and Garces 1950 by Bacheline Joseph

Свернуть
Список всех источников

Классификация

Питательные составы различаются по нескольким критериям — способу происхождения, назначению, консистенции. Способ получения является одним из основных критериев — он делит все существующие субстраты на две большие категории. А именно:

Естественные

Естественные составы производятся из натуральных веществ и компонентов — речной или морской воды, тканей живых организмов, растений. Отличаются сложным составом, который не во всех случаях можно точно определить. Сюда относятся бульоны, солодовое сусло, обезжиренное и гидролизованное молоко, овощные отвары, а также кровь и желчь.

Синтетические

Синтетические среды — это субстраты с максимально точным содержанием необходимых химических веществ. Их состав строго рассчитан, а значит полностью известен. Применяются для культивирования и изучения конкретных микроорганизмов — исследования их метаболизма, базовых свойств, способностей принимать вещества, которые подавляют или стимулируют развитие.

Также существуют полусинтетические микробиологические среды. Их основа выполнена из натуральных субстратов, но в состав вводят специальные вещества, обеспечивающие активное размножение культур. Такие субстраты чаще всего применяются в фармацевтике для получения аминокислот, антибиотиков и витаминов.

Рассмотрим также несколько видов субстратов в зависимости от назначения.

Дифференциально-диагностические

Дифференциально-диагностические среды необходимы для отделения разных видов микроорганизмов друг от друга с учётом их ферментативной активности или культуральных проявлений. Состав субстратов рассчитывается таким образом, чтобы было проще выявить свойства каждого вида микроорганизмов, опираясь на особенности обмена веществ. Сюда относятся среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса и пр. Дополнительно составы могут подкрашивать химическими красителями для идентификации, чтобы было удобнее разделять близкие культуры.

Элективные

Эти среды применяются для отбора и селективного (выборочного) выращивания биологических культур с определёнными качествами. Их состав подбирается таким образом, чтобы подавлять развитие бактерий других видов, но быть оптимальным для требуемой группы (вида) бактерий. Способы создания условий — регулировка кислотности, концентрации солей, питательных веществ. Либо добавление веществ, препятствующих развитию других микроорганизмов. К элективным относятся селенитовые, желчный бульон, щелочной агар, висмут-сульфит агар и пр.

Также существуют среды основные, специальные, консервирующие (транспортировочные), накопления.

Твердые, полужидкие и жидкие

По агрегатному состоянию все составы делятся на три типа. Основой любого субстрата является жидкая среда. Другая консистенция достигается добавлением веществ, повышающих плотность — желатина или агар-агара.

Жидкие питательные среды используют для накопления микроорганизмов и продуктов их метаболизма, а также для выявления их особенностей. Хранятся такие составы в ёмкостях с плотно завинчивающимися крышками или пробками.
К полужидким относятся субстраты, в составе которых от 0,2 до 0,7% агара. Чаще всего применяются для хранения культур.
У твёрдых в составе около 1,5-2,5 % агара. Такие питательные среды используют для выделения бактерий, изучения колоний, учёта количества, определения активности и свойств.

Также существуют сухие субстраты. Это высушенные и измельчённые в порошок вещества (или их комбинации), которые перед применением разводят и стерилизуют.

Подготовка и консервация

Перед автоклавированием важно отрегулировать правильный уровень pH среды.
Различные используемые индикаторы pH включают феноловый красный, нейтральный красный бромтимоловый синий, фиолетовый бромкрезол и так далее.
Обезвоженные среды можно приобрести в коммерческих целях и восстановить в соответствии с рекомендациями производителя.
Большинство питательных сред стерилизуют автоклавированием. Некоторые среды, содержащие термолабильные компоненты, такие как глюкозные антибиотики, мочевина, кровь и сыворотка, не требуют автоклавирования

Компоненты удаляют и добавляют после автоклавирования среды.
Некоторые высокоселективные среды, такие как среды Вильсона или Блэра, а также агар TCBS не требуют стерилизации.
После приготовления среду можно хранить при температуре 4-5°С и хранить в холодильнике до 1-2 недель.
Определенные жидкости, содержащиеся в бутылках с завинчивающимися крышками, тюбиках или бутылках с ватными пробками, можно хранить, доведя их до комнатной температуры в течение недели.

Почему бактерии приходится выращивать (культивировать) в лаборатории на искусственных питательных средах?

Одной из основных причин является его использование в диагностике инфекционных заболеваний. Способность изолировать организм от областей, которые обычно считаются стерильными, указывает на роль, которую он играет в процессе болезни. Фактически отделение организма от медицинского образца может быть самым первым шагом в доказательстве его позиции в качестве этиологического фактора.
Культивирование бактерий также является первым шагом в изучении их морфологии, а также в их распознавании.
Бактерии необходимо выращивать для извлечения антигенов для серологических тестов или вакцин.
Определенные генетические исследования и манипуляции с клетками требуют выращивания бактерий в лаборатории.
Культивирование бактерий также может быть точным методом оценки их количества (жизнеспособного числа).
Выращивание на твердых субстратах также является эффективным методом выделения бактерий из смесей.

Виды питательных сред

По составу питательные среды делят на:

Синтетические – представляют собой водные растворы химически чистых соединений в установленных дозировках. Состав таких питательных сред полностью известен, но используются они для немногих видов нетребовательных к питанию микроорганизмов.
Натуральные или естественные – состоят из продуктов животного или растительного происхождения. Химический состав таких сред сложен и точно не определен. К ним относят мясопептонный бульон и агар, солодовое сусло, сусло-агар, обезжиренное и гидролизованное молоко, отвары овощей.

По целевому назначению питательные среды делят на:

Основные – применяются для выращивания многих бактерий. К ним относят мясопептонный бульон (МПБ), триптические гидролизаты рыбных, мясных продуктов, казеина. Основные среды служат для приготовления сложных питательных сред. К ним добавляют молоко, сахар, кровь и прочие ингредиенты.
Селективные (избирательные) – предназначены для выделения и накопления микроорганизмов определенных видов или групп из объектов, содержащих разнообразную микрофлору. Сопутствующие микробы или совсем не растут на селективных средах или развитие их сильно подавляется. Разработка таких питательных сред основывается на биологических особенностях конкретных микроорганизмов, отличающих их от многих других.
Дифференциально-диагностические – позволяют быстро устанавливать и отличать группы микроорганизмов друг от друга. Их состав подбирается с расчетом четкого выявления характерных свойств конкретного вида. Во многих случаях это достигается введением в среды специальных красителей-индикаторов, окрашивающих колонии определяемых микробов в конкретные цвета.

По физическому состоянию питательные среды делят на:

Приготовление

Приготовление питательной среды включает несколько этапов, а именно:

взвешивание — отбор навески компонентов на аналитических весах;
растворение — для растворения применяется нагретая дистиллированная вода;
кипячение — для кипячения используется водяная баня;
установление pH — контролируется с помощью индикаторной бумаги;
фильтрация — производится через бумажные, матерчатые или ватно-марлевые фильтры (в зависимости от консистенции);
розлив по ёмкостям — не более, чем на ¾ ёмкости;
стерилизация — осуществляется различными термическими способами;
контроль — помещение в термостат на двое суток, затем — установление состава химическим путём или засев специальными культурами для проверки свойств.

Принцип питательных сред

Элементы в питательных средах могут варьироваться от чистых химических соединений до более сложных веществ, таких как перевары или экстракты тканей животных и растений. Если все компоненты среды для культивирования идентифицированы как количественно, так и качественно, она называется средой с определенным химическим составом. Они имеют огромное значение для изучения пищевых потребностей микроорганизмов или для изучения многообразия их метаболических действий. В очень сложной среде точный химический состав кукурузы до конца не ясен, и этот тип среды обычно изготавливается из сложных веществ, например биологических жидкостей, тканевых экстрактов и настоев.