Применение чистых культур в пищевой промышленности
Как используют дрожжи для выпечки хлебобулочных изделий или производства сусла для пива, широко известно. Но есть еще довольно большая группа микроорганизмов, необходимых для производства вкусных и полезных напитков.
Одной из самых, пожалуй, востребованных бактерий является молочнокислая или лактобактерия. Ее способность вырабатывать антибактериальные вещества и поддерживать здоровую микрофлору кишечника делает молочнокислую бактерию незаменимой для здоровья человека.
Молочнокислые бактерии используют для производства кефира, йогурта, простокваши, ряженки, различных сыров. Попадая в кишечник, молочнокислые бактерии способствуют выработке биологически активных веществ, витаминов и ферментов, которые жизненно необходимы нашему здоровью.
Молочнокислые бактерии имеют иммуномодулирующие свойства, что не может не радовать, но они могут приносить не только пользу. Молочнокислые бактерии запускают процесс брожения, в результате которого образуется молочная кислота, что не всегда полезно для продуктов. В частности, молочнокислые бактерии, попавшие в пиво или вино, могут испортить эти продукты.
В виноделии невозможно получить оригинальный вкус продукта без использования штамма винных дрожжей. Дело в том, что на винограде образуется определенная природная микрофлора (включая и молочнокислые бактерии), дающая самый различный вкус при сбраживании.
Чтобы получить заранее заданный вкус напитка, предварительно обрабатывают виноград, уничтожая все патогенные микроорганизмы, а затем вводят штамм винных дрожжей, что гарантирует получение нужного результата.
Понятие чистой культуры бактерий сформировалось в ХХ веке. Чистая культура была основой микробиологических исследований на протяжении довольно долгого времени. Однако ее поведение в стерильных лабораторных условиях существенно отличается от поведения микроорганизмов в природных условиях. Взаимодействие химических процессов в естественных микробных сообществах до сих пор мало изучено. Но это никоим образом не умаляет значимости чистой культуры для научных исследований.
Как вырастить чистую культуру микроорганизмов
Чистой культурой называют совокупность микроорганизмов одного вида, выращенных на питательных средах из одной клетки. Чистые культуры бактерий имеют одинаковые:
- морфологические свойства (форма и размеры);
- биохимические свойства (набор ферментов, позволяющих осуществлять дыхание, питание, размножение).
Существует несколько методов выделения чистых культур:
- Метод последовательных разведений (автор Л. Пастер) предполагает серию разведения в какой-либо питательной среде рабочего раствора (содержащего исследуемый материал) в различной концентрации. Как правило, линейка разведений включает пограничные и допустимые диапазоны контрольных штаммов (своего рода паспорт бактерий). Этот метод не слишком удобен и не дает возможность контролировать количество клеток при разведении.
- Метод пластинчатых разведений (автор Р. Кох) основан на использовании плотной (желеобразной) питательной среды. Суть метода заключается в том, что исследуемый материал вносится в пробирку с еще не застывшей питательной средой, а затем смесь выливается на плоскую поверхность. Таким образом, колонии бактерий могут образовываться в глубине желеобразного слоя и быть изолированными друг от друга. Что значительно облегчает перенос колонии и выращивание чистой культуры.
- Несколько усовершенствованный метод (автор Э. Дригальский) состоит в нанесении на питательную среду в чашке Петри исследуемого материала с помощью шпателя. Причем проводится одновременно несколько посевов одним и тем же инструментом в двух-трех чашках одновременно. В первом образце самая большая концентрация материала, а в следующем немного меньше и т. д. Это позволяет получить в последней чашке хорошо различимые изолированные колонии.
Чтобы получить действительно чистую культуру, нужно соблюсти множество условий, в которых происходит ее выращивание:
Различные методы посева (переноса материала на питательную среду) должны уберечь результат от посторонних включений. В качестве инструментов используют шпатель, иглу, ватный тампон, специальную бактериологическую петлю.
Питательная среда может быть синтетической или натуральной. По составу питательные среды разделяют на жидкие, полужидкие и плотные (в зависимости от содержания агар-агара)
В средах общего назначения можно выращивать различные виды бактерий, но определенные микроорганизмы требуют специальных питательных сред, которые приготавливают на основе общих сред.
Важно выдерживать оптимальные условия для развития колонии – температуру, влажность, наличие или отсутствие воздуха.
Методики проведения оценки возбудителя
Для получения чистых культур бактериальных клеток применяется ряд методов. Каждый из них применяется в той или иной ситуации и имеет последовательные четкие этапы получения колоний возбудителя заболевания. Рассмотрим наиболее популярные.
Методика Пастера
Представляет собой разведение чистых культур в среде для бактериального роста (жидкой консистенции) до получения концентрации с 1 клеткой на объем жидкости. Данный метод выделения имеет важнейшее историческое значение.
Методика Коха
Известна также как методика «пластинчатых разводок». Представляет собой разведение материала для исследования в агаре (в расплавленном состоянии с температурой 48-50°С). Далее полученный состав разливают по чашкам Петри, где он должен застыть.
Посевы обычно проводят с 3-4 последних разведений, так как бактерий там уже мало. Таким образом, при росте микробов на питательной среде проявляются обособленные колонии микроорганизмов, которые рождаются из единственной материнской клетки. Затем из глубины агара можно выбрать изолированную колонию, и пересеять ее на свежую питательную среду. Следующий этап – идентификация и выделение возбудителя.
Методика Шукевича
Используется при необходимости выделить чистую культуру аэробов протея либо каких-либо других микробов, характеризующихся «ползучим» ростом. Сеют культуры на воду, конденсированную у основания скошенного агара.
Методика Дригальского
Способ Дригальского довольно широко используется в исследовании биологического материала путем разведения культур в пробирке с бульоном либо с физиологическим раствором.
Следующий этап: одну каплю полученного раствора при помощи стерильного шпателя из стекла распределяют равномерно по поверхности среды питания в 1-ой чашке. Потом, не прожигая шпатель на огне, делают им же посев на 2-ой и 3-ей чаше. Суть метода Дригальского заключается в том, что с каждым последующим посевом культур концентрация бактерий (аэробов) все меньше. На 3-ей чашке они распределяются довольно обособленно, каждая бактериальная клетка при этом дает клональные клетки (в виде изолированной колонии). Их пересевают на скошенный агар для накопления возбудителей.
Методика Вейнберга
Определенные затруднения вызывает выделение чистых культур анаэробных возбудителей, если микроорганизмы не гибнут при контакте с кислородными молекулами. Суть методики заключается в выведении анаэробных микробов (в составе материала) в слегка остывшей (45-50°С) расплавленной среде питания (агарозированной). Проводят 6-10 разведений. Затем идет следующий этап: необходимо быстро охладить состав в пробирке и залить ее поверхность смесью из масла вазелина и парафина, что препятствует проникновению воздуха и способствует развитию анаэробных условий.
При благоприятном посеве прорастают изолированные колонии на второй день, которые можно извлечь из пробирки путем ее нагревания при помощи горелки. Из разрезанного агарового столбика петлей набирают культуры для дальнейшего исследования. Полученные колонии размещают в жидкую питательную среду, на чем этапы выделения колонии анаэробных возбудителей можно завершить.
Методика Хангейта
Ее часто применяют для выделения аэробных микробов, обладающих высокой кислородочувствительностью. В проведении такого выделения культуры аэробов применяется методика вращения пробирок.
Методы засевания аэробных бактерий предполагают выведение их на агаризированной расплавленной среде. Наличие инертного газа в пробирке дает возможность вырастить изолированные колонны аэробных бактерий таким образом, что выделенные культуры аэробов хорошо можно увидеть даже невооруженным глазом на 2-3 день.
Микроманипулятор
Это методика выделения отдельных бактериальных клеток путем применения микроманипулятора. Микроманипулятор представляет собой специальный прибор, которым можно выловить из суспензии одну клетку, а также обеспечить возможность посева культуры в пробирку.
Дальнейшая идентификация возбудителя проводится с учетом всех перечисленных свойств возбудителя (аэробов и анаэробов), а также особенностей их взаимодействия с различными веществами.
Метод Дригальского: этапы выделения чистой культуры и ее идентификации
Свойства микроорганизмов, учитываемые при выделении культуры
Принципы биологического разъединения бактерий подразумевают учет особенностей жизнедеятельности микробов с целью выбрать наиболее оптимальные методы исследования. Выбранные методы должны соответствовать возбудителю по определенным параметрам.
- Тип дыхания. Среди бактерий выделяют группы аэробных и анаэробных представителей. Для получения анаэробных микробов материал для исследования прогревают. Следующий этап – культивирование микроба в анаэробных условиях. Методики получения аэробных и анаэробных бактерий различны.
- Спорообразование. Способность некоторых бактерий к спорообразованию обеспечивает защиту и сохранность микроорганизмов.
- Устойчивость бактерий к агрессивному воздействию щелочей и кислот. Устойчивость некоторых видов бактерий к данным веществам обеспечивает максимальное очищение исследуемого материала от примеси других бактерий с применением растворов щелочи либо кислоты.
- Подвижность бактериальных организмов. Для отделения чистой культуры подвижных микроорганизмов используются методы отделения культур микробов в капле конденсата.
- Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам, некоторым химическим веществам и другим антимикробным средствам. Для некоторых возбудителей наиболее предпочтительны методы выделения культур с применением селективных (специфических) питательных сред.
- Антибиотики. Очищают материал от дополнительных микроорганизмов.
- Способность бактерий проникать сквозь неповрежденные кожные покровы. Это свойство присуще некоторым разновидностям, которые обладают факторами агрессии.
- Чувствительность животных к некоторым болезням инфекционного генеза.
